Um filtro de fluorescência é um componente essencial no microscópio de fluorescência.Um sistema típico possui três filtros básicos: um filtro de excitação, um filtro de emissão e um espelho dicróico.Eles são comumente embalados em um cubo para que o grupo seja inserido junto no microscópio.
Como funciona um filtro de fluorescência?
Filtro de excitação
Os filtros de excitação transmitem luz de um comprimento de onda específico e bloqueiam outros comprimentos de onda.Eles podem ser usados para produzir cores diferentes ajustando o filtro para permitir a passagem de apenas uma cor.Os filtros de excitação vêm em dois tipos principais – filtros passa-longa e filtros passa-banda.O excitador é geralmente um filtro passa-banda que passa apenas os comprimentos de onda absorvidos pelo fluoróforo, minimizando assim a excitação de outras fontes de fluorescência e bloqueando a luz de excitação na banda de emissão de fluorescência.Conforme mostrado pela linha azul na figura, a PA é 460-495, o que significa que só pode passar pela fluorescência de 460-495 nm.
Ele é colocado dentro do caminho de iluminação de um microscópio de fluorescência e filtra todos os comprimentos de onda da fonte de luz, exceto a faixa de excitação do fluoróforo.A transmissão mínima do filtro determina o brilho e o brilho das imagens.Recomenda-se um mínimo de transmissão de 40% para qualquer filtro de excitação, de modo que a transmissão seja idealmente >85%.A largura de banda do filtro de excitação deve estar inteiramente dentro da faixa de excitação do fluoróforo, de modo que o comprimento de onda central (CWL) do filtro seja o mais próximo possível do comprimento de onda de excitação de pico do fluoróforo.A densidade óptica (OD) do filtro de excitação determina a escuridão da imagem de fundo;OD é uma medida de quão bem um filtro bloqueia os comprimentos de onda fora da faixa de transmissão ou largura de banda.Recomenda-se uma DO mínima de 3,0, mas uma DO de 6,0 ou superior é o ideal.
Filtro de Emissão
Os filtros de emissão servem ao propósito de permitir que a fluorescência desejável da amostra chegue ao detector.Eles bloqueiam comprimentos de onda mais curtos e têm alta transmissão para comprimentos de onda mais longos.O tipo de filtro também está associado a um número, por exemplo BA510IF na figura (filtro de barreira de interferência), cuja designação se refere ao comprimento de onda a 50% de sua transmissão máxima.
As mesmas recomendações para filtros de excitação são válidas para filtros de emissão: transmissão mínima, largura de banda, OD e CWL.Um filtro de emissão com a combinação ideal de CWL, transmissão mínima e OD fornece as imagens mais brilhantes possíveis, com o bloqueio mais profundo possível e garante a detecção dos sinais de emissão mais fracos.
Espelho Dicróico
O espelho dicróico é colocado entre o filtro de excitação e o filtro de emissão em um ângulo de 45° e reflete o sinal de excitação em direção ao fluoróforo enquanto transmite o sinal de emissão em direção ao detector.Os filtros dicróicos e divisores de feixe ideais têm transições nítidas entre a reflexão máxima e a transmissão máxima, com uma reflexão >95% para a largura de banda do filtro de excitação e uma transmissão de >90% para a largura de banda do filtro de emissão.Selecione o filtro com o comprimento de onda de interseção (λ) do fluoróforo em mente, para minimizar a luz difusa e maximizar a relação sinal-ruído da imagem fluorescente.
O espelho dicróico nesta figura é o DM505, assim chamado porque 505 nanômetros é o comprimento de onda a 50% da transmissão máxima deste espelho.A curva de transmissão para este espelho mostra alta transmissão acima de 505 nm, uma queda acentuada na transmissão à esquerda de 505 nanômetros e refletividade máxima à esquerda de 505 nanômetros, mas ainda pode ter alguma transmissão abaixo de 505 nm.
Qual é a diferença entre filtros passa longo e passa banda?
Os filtros de fluorescência podem ser divididos em dois tipos: passa longo (LP) e passa banda (BP).
Os filtros de passagem longa transmitem comprimentos de onda longos e bloqueiam os mais curtos.O comprimento de onda de corte é o valor de 50% do pico de transmissão, e todos os comprimentos de onda acima do corte são transmitidos pelos filtros passa-longa.Eles são frequentemente utilizados em espelhos dicróicos e filtros de emissão.Filtros passa-longo devem ser usados quando a aplicação requer coleta máxima de emissões e quando a discriminação espectral não é desejável ou necessária, o que geralmente é o caso de sondas que geram uma única espécie emissora em amostras com níveis relativamente baixos de autofluorescência de fundo.
Os filtros passa-banda transmitem apenas uma determinada banda de comprimento de onda e bloqueiam outras.Eles reduzem a diafonia, permitindo que apenas a porção mais forte do espectro de emissão do fluoróforo seja transmitida, reduzem o ruído de autofluorescência e, assim, melhoram a relação sinal-ruído em amostras de autofluorescência de fundo alto, que os filtros de passagem longa não podem oferecer.
Quantos tipos de conjuntos de filtros de fluorescência o BestScope pode fornecer?
Alguns tipos comuns de filtros incluem filtros azuis, verdes e ultravioleta.Conforme mostrado na tabela.
| Conjunto de filtros | Filtro de excitação | Espelho Dicróico | Filtro de Barreira | Comprimento de onda da lâmpada LED | Aplicativo |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: método de anticorpo fluorescente ·Laranja de ácido: DNA, RNA ·Auramina: Bacilo da tuberculose ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 nm | ·Rodamina, TRITC: método de anticorpo fluorescente ·Iodeto de propídio: DNA ·RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | ·Observação de auto-fluorescência ·DAPI: coloração de DNA ·Hoechest 332528, 33342: usado para coloração cromossômica |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | ·Catecolaminas ·5-hidroxitriptamina ·Tetraciclina: Esqueleto, Dentes |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Os conjuntos de filtros usados em aquisições de fluorescência são projetados em torno dos principais comprimentos de onda usados em aplicações de fluorescência, que são baseados nos fluoróforos mais usados.Por esse motivo, eles também recebem o nome do fluoróforo ao qual se destinam à geração de imagens, como cubos de filtro DAPI (azul), FITC (verde) ou TRITC (vermelho).
| Conjunto de filtros | Filtro de excitação | Espelho Dicróico | Filtro de Barreira | Comprimento de onda da lâmpada LED |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-Auramina | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Vermelho Texas | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 nm |
Como você escolhe um filtro de fluorescência?
1. O princípio de seleção do filtro de fluorescência é deixar a luz de fluorescência/emissão passar pela extremidade da imagem o máximo possível e bloquear completamente a luz de excitação ao mesmo tempo, de modo a obter a maior relação sinal-ruído.Especialmente para a aplicação de excitação multifotônica e microscópio de reflexão interna total, o ruído fraco também causará grande interferência no efeito de imagem, portanto, a exigência de relação sinal-ruído é maior.
2. Conhecer o espectro de excitação e emissão do fluoróforo.Para construir um conjunto de filtros de fluorescência que gere uma imagem de alta qualidade e alto contraste com fundo preto, os filtros de excitação e emissão devem atingir alta transmissão com mínima ondulação de banda passante sobre as regiões que correspondem aos picos de excitação ou emissões do fluoróforo.
3. Considere a durabilidade dos filtros fluorescentes.Esses filtros devem ser impermeáveis a fontes de luz intensa que geram luz ultravioleta (UV) que pode levar ao “burnout”, principalmente do filtro excitador, pois está sujeito à intensidade total da fonte de iluminação.
As diferentes imagens de amostras fluorescentes
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Horário da postagem: 09/12/2022